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HRP/ALP標(biāo)記SA在診斷試劑中的應(yīng)用及評(píng)價(jià)


  體外診斷     |      2026-02-11
酶標(biāo)抗體和蛋白是現(xiàn)代免疫診斷試劑的核心信號(hào)放大元件。其中,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的鏈霉親和素(SA)等試劑,因其高靈敏度、強(qiáng)特異性,在疾病診斷、食品安全、科研等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文將從應(yīng)用場(chǎng)景、標(biāo)記工藝性能評(píng)價(jià),對(duì)HRP標(biāo)記鏈霉親和素及ALP標(biāo)記鏈霉親和素進(jìn)行梳理。
一、主要產(chǎn)品的應(yīng)用場(chǎng)景與標(biāo)記工藝
1.1 HRP標(biāo)記鏈霉親和素
應(yīng)用場(chǎng)景:鏈霉親和素對(duì)生物素具有極高的親和力(Kd≈10-15M)。HRP標(biāo)記后,它成為生物素-親和素放大系統(tǒng)的核心組件。該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于免疫層析試紙條ELISA免疫印跡實(shí)驗(yàn),尤其適用于獸藥殘留、食品安全高通量檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。通過(guò)與生物素標(biāo)記的一抗或二抗結(jié)合,可極大增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。
標(biāo)記工藝:采用高純度鏈霉親和素HRP共價(jià)偶聯(lián)的工藝制備。為確保產(chǎn)品性能穩(wěn)定、批間差異小,生產(chǎn)過(guò)程中需精確控制偶聯(lián)比例和純化步驟,以獲得高比活性、低非特異性吸附的偶聯(lián)物。
圖1 HRP標(biāo)記抗體原理圖
1.2 ALP標(biāo)記鏈霉親和素
應(yīng)用場(chǎng)景:堿性磷酸酶(ALP)是另一類(lèi)重要的報(bào)告酶。ALP標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-ALP)同樣用于生物素檢測(cè)系統(tǒng),適用于Western印跡、ELISA、免疫組織化學(xué)等多種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。與HRP系統(tǒng)相比,ALP系統(tǒng)在堿性條件下工作,其底物(如BCIP/NBT)產(chǎn)生的顏色沉淀更穩(wěn)定,適用于需要長(zhǎng)期保存的膜檢測(cè)或切片。
標(biāo)記工藝:通過(guò)化學(xué)交聯(lián)將ALP與鏈霉親和素連接。目前常用的堿性磷酸酶偶聯(lián)方法有過(guò)碘酸鈉氧化法、碳二亞胺法和SMCC異性雙功能偶聯(lián)法(如圖2及3所示)等。過(guò)碘酸鈉氧化法是先將酶進(jìn)行醛基化,然后和抗體偶聯(lián),這種操作比較復(fù)雜,偶聯(lián)產(chǎn)物有效活性濃度低。碳二亞胺法利用碳二亞胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行羧基化,這種方法容易形成蛋白分子間的自身聚合,產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物。SMCC異性雙功能偶聯(lián)法利用SMCC的異性官能團(tuán),分別連接堿性磷酸酶和抗體,這種方法相比過(guò)碘酸鈉法和碳二亞胺法偶聯(lián)效率高。
圖2 SMCC活化酶圖3 抗體活化及連接酶
二、酶標(biāo)抗體/蛋白評(píng)價(jià)
西寶生物自產(chǎn)的兩款SA標(biāo)記物如下:
序號(hào)
物料名稱(chēng)
貨號(hào)
1
Seebio? 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)
ECD0720E
2
Seebio? 堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-ALP)
ECT6750B
2.1 HRP標(biāo)記鏈霉親和素的性能評(píng)價(jià)
1)將純化好的鼠IgG按照一定濃度包被96孔板備用。
2)將純化后的羊抗兔標(biāo)記的生物素結(jié)合物并進(jìn)行純化,配制成一定濃度試劑備用。
3)將西寶生物與進(jìn)口JACKSON的HRP標(biāo)記SA采用合適的稀釋液配制為相同的工作濃度。
4)將兔抗鼠-IgG使用1xPBS按照如下濃度50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0ng/mL配制完成。
5)配制好的梯度樣品按照每孔50ul加入包被的發(fā)光板中,再加入羊抗兔-生物素試劑與酶結(jié)合物按照每孔各50ul加入包被的發(fā)光板中,37℃反應(yīng)20min后洗板。
6)將反應(yīng)好的板去除上清液,并用清洗液進(jìn)行洗滌,每塊板洗滌三次。
7)在洗滌完成的板中加入100ul發(fā)光底物,37℃孵育5min,加入100ul終止液,在酶標(biāo)儀上測(cè)OD值,并導(dǎo)出、處理、匯總數(shù)據(jù)。
2.1.1 與參比物料比對(duì)及批間差異
序號(hào)
鼠IgG濃度ng/mL
JACKSON HRP-SA
西寶SA-HRP批次1
西寶SA-HRP批次2
西寶批次1與JACKSON偏差1
西寶批次2與西寶批次1偏差
OD值
S0
0
0.177
0.185
0.180
4.8%
-3.0%
S1
0.78
0.282
0.287
0.297
1.8%
3.5%
S2
1.56
0.378
0.395
0.407
4.4%
3.2%
S3
3.125
0.514
0.522
0.547
1.6%
4.9%
S4
6.25
0.699
0.717
0.739
2.6%
3.0%
S5
12.5
1.171
1.200
1.231
2.4%
2.6%
S6
25
2.259
2.313
2.373
2.4%
2.6%
S7
50
3.026
3.168
3.298
4.7%
4.1%
平均偏差(不含S0)
2.8%
3.4%
分析:
1)采用西寶SA-HRP批次1與進(jìn)口JACKSON SA-HRP做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差2.8%,說(shuō)明西寶SA-HRP與進(jìn)口JACKSON SA-HRP性能相當(dāng),可進(jìn)行國(guó)產(chǎn)替代;
2)采用西寶SA-HRP批次2與西寶SA-HRP批次1做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差3.4%,說(shuō)明西寶SA-HRP批間差異小。
2.1.2 濃縮液熱穩(wěn)定性
濃縮液37℃熱加速試驗(yàn)
序號(hào)
鼠IgG濃度
ng/mL
西寶HRP-SA批次1
西寶HRP-SA批次2
37℃熱加速7天偏差
S0
0
-2.3%
-3.5%
S3
3.125
-5.2%
-1.9%
S5
12.5
3.7%
-2.0%
S7
50
5.4%
-7.9%
平均偏差(不含S0)
1.3%
-4.0%
分析:將西寶HRP-SA批次1及批次2濃縮液分別做37℃熱加速實(shí)驗(yàn),結(jié)果熱加速7天平均變化分別為1.3%、-4.0%,表明西寶HRP-SA濃縮液熱穩(wěn)定性良好。
2.2 ALP標(biāo)記鏈霉親和素在診斷領(lǐng)域具體項(xiàng)目中的性能評(píng)價(jià)
1)將磁珠包被的肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體(抗體貨號(hào):EKY0095J)用合適的稀釋液稀釋成工作液1。
2)將生物素標(biāo)記肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體(抗體貨號(hào):EKY0095K)用合適的稀釋液稀釋成工作液2。
3)將SA-ALP用用合適的稀釋液稀釋成工作液3。
4)上全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀器進(jìn)行測(cè)試CK-MB抗原(抗原貨號(hào):EDD0408B)梯度,記錄發(fā)光值。
2.2.1 與參比物料比對(duì)及批間差異
序號(hào)
CK-MB抗原梯度濃度ng/mL
參比(國(guó)產(chǎn)某品牌B)SA-ALP
西寶SA-ALP批次1
西寶SA-ALP批次2
西寶批次1與參比(國(guó)產(chǎn)某品牌B)偏差1
西寶批次2與西寶批次1偏差
發(fā)光值
S0
0
36002
32134
31020
-10.7%
-3.5%
S1
5
766757
827327
848569
7.9%
2.6%
S2
25
3713404
4027799
4468606
8.5%
10.9%
S3
50
8218435
9586135
9854945
16.6%
2.8%
S4
150
25728888
30214488
29524235
17.4%
-2.3%
S5
300
48997524
56878355
54552327
16.1%
-4.1%
平均偏差(不含S0)
13.3%
2.0%
分析:
1)采用西寶SA-ALP批次1與參比廠家(國(guó)產(chǎn)某品牌B)SA-ALP做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差13.3%,說(shuō)明西寶SA-ALP與參比廠家(國(guó)產(chǎn)某品牌B) SA-ALP性能相當(dāng),可進(jìn)行替代;
2)采用西寶SA-ALP批次2與西寶SA-ALP批次1做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差2.0%,說(shuō)明西寶SA-ALP批間差異小。
2.2.2 濃縮液熱穩(wěn)定性
濃縮液37℃熱加速試驗(yàn)
序號(hào)
CK-MB抗原
梯度濃度ng/mL
西寶SA-ALP批次1
西寶SA-ALP批次2
37℃熱加速7天偏差
S0
0
3.3%
2.5%
S1
5
5.2%
-3.1%
S2
25
3.8%
-2.8%
S3
50
1.9%
-2.6%
S4
150
-1.4%
-1.0%
S5
300
0.1%
-2.8%
平均偏差(不含S0)
1.9%
-2.5%
分析:將西寶SA-ALP批次1及批次2濃縮液分別做37℃熱加速實(shí)驗(yàn),結(jié)果熱加速7天平均變化分別為1.9%、-2.5%,表明西寶SA-ALP濃縮液熱穩(wěn)定性良好。
三.產(chǎn)品訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱(chēng)
貨號(hào)
備注
Seebio? 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和親和素(SA-HRP)
ECD0720E
500ug、1mg、5mg
Seebio? 堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-ALP)
ECT6750B
500ug、1mg、5mg
HRP標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)
016-030-084
1mg
辣根過(guò)氧化物酶(HRP)
ECE0066Z
100mg、500mg、1g
鏈霉親和素(5型)
ECL0006Y
5mg、100mg
Seebio? 重組堿性磷酸酶(高活性)
DCE0108L
5mg、25mg、100mg
羊抗兔IgG
ECY4491C
50mg
小鼠IgG(凍干粉)
EKN0346B
25mg、100mg
兔抗小鼠IgG(H+L)
DCY0259B
5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體
EKY0095J
1mg、5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體
EKY0095K
1mg、5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗原
EDD0408B
100ug、1mg
AMPPD 發(fā)光底物液(即用型)
DCD0517B
100ml、1L
APS-5發(fā)光底物液(即用型)
ECD0532M
100ml、1L

 

酶標(biāo)抗體和蛋白是現(xiàn)代免疫診斷試劑的核心信號(hào)放大元件。其中,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的鏈霉親和素(SA)等試劑,因其高靈敏度、強(qiáng)特異性,在疾病診斷、食品安全、科研等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文將從應(yīng)用場(chǎng)景、標(biāo)記工藝性能評(píng)價(jià),對(duì)HRP標(biāo)記鏈霉親和素及ALP標(biāo)記鏈霉親和素進(jìn)行梳理。
一、主要產(chǎn)品的應(yīng)用場(chǎng)景與標(biāo)記工藝
1.1 HRP標(biāo)記鏈霉親和素
應(yīng)用場(chǎng)景:鏈霉親和素對(duì)生物素具有極高的親和力(Kd≈10-15M)。HRP標(biāo)記后,它成為生物素-親和素放大系統(tǒng)的核心組件。該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于免疫層析試紙條ELISA免疫印跡實(shí)驗(yàn),尤其適用于獸藥殘留食品安全高通量檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。通過(guò)與生物素標(biāo)記的一抗或二抗結(jié)合,可極大增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。
標(biāo)記工藝:采用高純度鏈霉親和素HRP共價(jià)偶聯(lián)的工藝制備。為確保產(chǎn)品性能穩(wěn)定、批間差異小,生產(chǎn)過(guò)程中需精確控制偶聯(lián)比例和純化步驟,以獲得高比活性、低非特異性吸附的偶聯(lián)物。
圖1 HRP標(biāo)記抗體原理圖
1.2 ALP標(biāo)記鏈霉親和素
應(yīng)用場(chǎng)景:堿性磷酸酶(ALP)是另一類(lèi)重要的報(bào)告酶。ALP標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-ALP)同樣用于生物素檢測(cè)系統(tǒng),適用于Western印跡、ELISA、免疫組織化學(xué)等多種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。與HRP系統(tǒng)相比,ALP系統(tǒng)在堿性條件下工作,其底物(如BCIP/NBT)產(chǎn)生的顏色沉淀更穩(wěn)定,適用于需要長(zhǎng)期保存的膜檢測(cè)或切片。
標(biāo)記工藝:通過(guò)化學(xué)交聯(lián)將ALP與鏈霉親和素連接。目前常用的堿性磷酸酶偶聯(lián)方法有過(guò)碘酸鈉氧化法、碳二亞胺法和SMCC異性雙功能偶聯(lián)法(如圖2及3所示)等。過(guò)碘酸鈉氧化法是先將酶進(jìn)行醛基化,然后和抗體偶聯(lián),這種操作比較復(fù)雜,偶聯(lián)產(chǎn)物有效活性濃度低。碳二亞胺法利用碳二亞胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行羧基化,這種方法容易形成蛋白分子間的自身聚合,產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物。SMCC異性雙功能偶聯(lián)法利用SMCC的異性官能團(tuán),分別連接堿性磷酸酶和抗體,這種方法相比過(guò)碘酸鈉法和碳二亞胺法偶聯(lián)效率高。
圖2 SMCC活化酶圖3 抗體活化及連接酶
二、酶標(biāo)抗體/蛋白評(píng)價(jià)
西寶生物自產(chǎn)的兩款SA標(biāo)記物如下:
序號(hào)
物料名稱(chēng)
貨號(hào)
1
Seebio? 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)
ECD0720E
2
Seebio? 堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-ALP)
ECT6750B
2.1 HRP標(biāo)記鏈霉親和素的性能評(píng)價(jià)
1)將純化好的鼠IgG按照一定濃度包被96孔板備用。
2)將純化后的羊抗兔標(biāo)記的生物素結(jié)合物并進(jìn)行純化,配制成一定濃度試劑備用。
3)將西寶生物與進(jìn)口JACKSON的HRP標(biāo)記SA采用合適的稀釋液配制為相同的工作濃度。
4)將兔抗鼠-IgG使用1xPBS按照如下濃度50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0ng/mL配制完成。
5)配制好的梯度樣品按照每孔50ul加入包被的發(fā)光板中,再加入羊抗兔-生物素試劑與酶結(jié)合物按照每孔各50ul加入包被的發(fā)光板中,37℃反應(yīng)20min后洗板。
6)將反應(yīng)好的板去除上清液,并用清洗液進(jìn)行洗滌,每塊板洗滌三次。
7)在洗滌完成的板中加入100ul發(fā)光底物,37℃孵育5min,加入100ul終止液,在酶標(biāo)儀上測(cè)OD值,并導(dǎo)出、處理、匯總數(shù)據(jù)。
2.1.1 與參比物料比對(duì)及批間差異
序號(hào)
鼠IgG濃度ng/mL
JACKSON HRP-SA
西寶SA-HRP批次1
西寶SA-HRP批次2
西寶批次1與JACKSON偏差1
西寶批次2與西寶批次1偏差
OD值
S0
0
0.177
0.185
0.180
4.8%
-3.0%
S1
0.78
0.282
0.287
0.297
1.8%
3.5%
S2
1.56
0.378
0.395
0.407
4.4%
3.2%
S3
3.125
0.514
0.522
0.547
1.6%
4.9%
S4
6.25
0.699
0.717
0.739
2.6%
3.0%
S5
12.5
1.171
1.200
1.231
2.4%
2.6%
S6
25
2.259
2.313
2.373
2.4%
2.6%
S7
50
3.026
3.168
3.298
4.7%
4.1%
平均偏差(不含S0)
2.8%
3.4%
分析:
1)采用西寶SA-HRP批次1與進(jìn)口JACKSON SA-HRP做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差2.8%,說(shuō)明西寶SA-HRP與進(jìn)口JACKSON SA-HRP性能相當(dāng),可進(jìn)行國(guó)產(chǎn)替代;
2)采用西寶SA-HRP批次2與西寶SA-HRP批次1做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差3.4%,說(shuō)明西寶SA-HRP批間差異小。
2.1.2 濃縮液熱穩(wěn)定性
濃縮液37℃熱加速試驗(yàn)
序號(hào)
鼠IgG濃度
ng/mL
西寶HRP-SA批次1
西寶HRP-SA批次2
37℃熱加速7天偏差
S0
0
-2.3%
-3.5%
S3
3.125
-5.2%
-1.9%
S5
12.5
3.7%
-2.0%
S7
50
5.4%
-7.9%
平均偏差(不含S0)
1.3%
-4.0%
分析:將西寶HRP-SA批次1及批次2濃縮液分別做37℃熱加速實(shí)驗(yàn),結(jié)果熱加速7天平均變化分別為1.3%、-4.0%,表明西寶HRP-SA濃縮液熱穩(wěn)定性良好。
2.2 ALP標(biāo)記鏈霉親和素在診斷領(lǐng)域具體項(xiàng)目中的性能評(píng)價(jià)
1)將磁珠包被的肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體(抗體貨號(hào):EKY0095J)用合適的稀釋液稀釋成工作液1。
2)將生物素標(biāo)記肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體(抗體貨號(hào):EKY0095K)用合適的稀釋液稀釋成工作液2。
3)將SA-ALP用用合適的稀釋液稀釋成工作液3。
4)上全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀器進(jìn)行測(cè)試CK-MB抗原(抗原貨號(hào):EDD0408B)梯度,記錄發(fā)光值。
2.2.1 與參比物料比對(duì)及批間差異
序號(hào)
CK-MB抗原梯度濃度ng/mL
參比(國(guó)產(chǎn)某品牌B)SA-ALP
西寶SA-ALP批次1
西寶SA-ALP批次2
西寶批次1與參比(國(guó)產(chǎn)某品牌B)偏差1
西寶批次2與西寶批次1偏差
發(fā)光值
S0
0
36002
32134
31020
-10.7%
-3.5%
S1
5
766757
827327
848569
7.9%
2.6%
S2
25
3713404
4027799
4468606
8.5%
10.9%
S3
50
8218435
9586135
9854945
16.6%
2.8%
S4
150
25728888
30214488
29524235
17.4%
-2.3%
S5
300
48997524
56878355
54552327
16.1%
-4.1%
平均偏差(不含S0)
13.3%
2.0%
分析:
1)采用西寶SA-ALP批次1與參比廠家(國(guó)產(chǎn)某品牌B)SA-ALP做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差13.3%,說(shuō)明西寶SA-ALP與參比廠家(國(guó)產(chǎn)某品牌B) SA-ALP性能相當(dāng),可進(jìn)行替代;
2)采用西寶SA-ALP批次2與西寶SA-ALP批次1做性能對(duì)比,結(jié)果平均偏差2.0%,說(shuō)明西寶SA-ALP批間差異小。
2.2.2 濃縮液熱穩(wěn)定性
濃縮液37℃熱加速試驗(yàn)
序號(hào)
CK-MB抗原
梯度濃度ng/mL
西寶SA-ALP批次1
西寶SA-ALP批次2
37℃熱加速7天偏差
S0
0
3.3%
2.5%
S1
5
5.2%
-3.1%
S2
25
3.8%
-2.8%
S3
50
1.9%
-2.6%
S4
150
-1.4%
-1.0%
S5
300
0.1%
-2.8%
平均偏差(不含S0)
1.9%
-2.5%
分析:將西寶SA-ALP批次1及批次2濃縮液分別做37℃熱加速實(shí)驗(yàn),結(jié)果熱加速7天平均變化分別為1.9%、-2.5%,表明西寶SA-ALP濃縮液熱穩(wěn)定性良好。
三.產(chǎn)品訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱(chēng)
貨號(hào)
備注
Seebio? 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和親和素(SA-HRP)
ECD0720E
500ug、1mg、5mg
Seebio? 堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-ALP)
ECT6750B
500ug、1mg、5mg
HRP標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)
016-030-084
1mg
辣根過(guò)氧化物酶(HRP)
ECE0066Z
100mg、500mg、1g
鏈霉親和素(5型)
ECL0006Y
5mg、100mg
Seebio? 重組堿性磷酸酶(高活性)
DCE0108L
5mg、25mg、100mg
羊抗兔IgG
ECY4491C
50mg
小鼠IgG(凍干粉)
EKN0346B
25mg、100mg
兔抗小鼠IgG(H+L)
DCY0259B
5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體
EKY0095J
1mg、5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗體
EKY0095K
1mg、5mg
肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗原
EDD0408B
100ug、1mg
AMPPD 發(fā)光底物液(即用型)
DCD0517B
100ml、1L
APS-5發(fā)光底物液(即用型)
ECD0532M
100ml、1L