摘要：研究發(fā)現(xiàn)，短暫抑制組蛋白去乙?；福℉DAC）可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞（mESCs）產(chǎn)生基因表達和三維（3D）基因組折疊的細胞記憶。

為了破壞小鼠胚胎干細胞（mESCs）的染色質(zhì)狀態(tài)平衡，研究團隊用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑曲古抑菌素A（TSA）對細胞進行4小時的脈沖處理。通過優(yōu)化條件，使組蛋白超乙?；粡娏艺T導(dǎo)，而乙酰化組和細胞周期進程的影響最小。校準的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）顯示，急性TSA處理誘導(dǎo)了全基因組范圍的H3K27超乙?；?，發(fā)生在順式調(diào)控元件、基因體和基因間區(qū)域。通過將基因組區(qū)間分類為活躍（富含H3K27ac、H3K4me1或H3K4me3）和抑制（富含H3K9me3、H3K27me3或H2AK119ub）狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)TSA處理導(dǎo)致更大比例的基因組處于活躍狀態(tài)。差異ChIP-seq峰的基因注釋指向發(fā)育過程的放大和多能性的抑制。

 圖1 瞬時性組蛋白去乙酰化酶抑制可誘導(dǎo)基因表達與三維基因組折疊的細胞記憶形成

批量RNA測序（RNA-seq）分析顯示，HDAC抑制對轉(zhuǎn)錄組的影響與組蛋白景觀的變化相吻合。下調(diào)基因與干細胞群體維持相關(guān)，而上調(diào)基因與神經(jīng)譜系的發(fā)育成熟相關(guān)。因此，急性HDAC抑制導(dǎo)致H3K27ac的廣泛積累和組蛋白修飾景觀的全局變化，促進與多能性退出相關(guān)的基因表達程序。

全局和局部結(jié)構(gòu)變化標記TSA染色質(zhì)狀態(tài)

成像研究表明，TSA處理在全局和局部尺度上導(dǎo)致染色質(zhì)解壓縮。為了解這些改變?nèi)绾无D(zhuǎn)化為染色質(zhì)接觸的變化，生成了超深Micro-C圖譜。數(shù)據(jù)顯示，TSA處理導(dǎo)致反式（trans）接觸顯著增加，同時順式（cis）相互作用顯著減少。TSA處理還導(dǎo)致顯著的A區(qū)室相互作用（ESCs的特征）減少，而B-B相互作用（分化細胞的特征）在順式中變得突出。A和B區(qū)室受到TSA不對稱影響，A區(qū)室中激活組蛋白標記的增益超過B區(qū)室，大多數(shù)基因表達失調(diào)對應(yīng)于位于A區(qū)室的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSSs）。

通過機械三維聚合物建模模擬TSA誘導(dǎo)的變化，發(fā)現(xiàn)TSA構(gòu)象與A結(jié)構(gòu)域比B結(jié)構(gòu)域剛度增加更大兼容。剛度變化成功預(yù)測了實驗中觀察到的區(qū)室強度轉(zhuǎn)換，而無需修改A-A和B-B吸引能。模型還預(yù)測了模擬核中A結(jié)構(gòu)域的周邊位移，這通過H3K27ac免疫熒光得到證實，顯示TSA處理細胞中H3K27ac焦點更接近核周邊。

隨后表征了染色質(zhì)環(huán)的變化。識別出3000多個具有差異環(huán)強度的焦點相互作用，這些相互作用與發(fā)育基因座強烈相關(guān)。雖然檢測到TSA中CTCF結(jié)合增加，但CTCF介導(dǎo)的環(huán)整體變?nèi)?。相反，非CTCF環(huán)（攜帶激活或抑制染色質(zhì)特征）在TSA處理后變得更強。使用核HDAC抑制劑羅米地辛進行實驗，揭示了幾乎相同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和3D基因組折疊的類似變化。

表觀基因組和結(jié)構(gòu)變化調(diào)控基因表達變化

為了解TSA誘導(dǎo)基因表達失調(diào)的表觀基因組變化，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的TSSs富含在TSA中獲得信號的H3K27ac峰，而信號減少的H3K27ac峰更常見于下調(diào)的TSSs。H3K27ac的增益伴隨著染色質(zhì)可及性的適度增加和H3K4me1的顯著增益。在一大部分上調(diào)基因中檢測到重疊的H3K4me3和H3K27me3信號，暗示雙價基因易受TSA介導(dǎo)的基因去抑制影響，而不喪失H3K27me3。

為了解轉(zhuǎn)錄上調(diào)是否由異位增強子激活引起，檢查了獲得H3K4me1的基因組區(qū)域與TSSs的線性接近度。揭示這些峰比不上調(diào)的表達匹配對照基因的啟動子更接近上調(diào)的基因啟動子。類似地，上調(diào)的TSSs被發(fā)現(xiàn)更接近先前描述的預(yù)備和 poised 增強子。由于增強子激活和隨后的基因表達通常伴隨著增強子-啟動子（E-P）接觸的增加，分析了上調(diào)TSSs處染色質(zhì)環(huán)的變化。雖然檢測到環(huán)與上調(diào)TSSs的線性接近度增加，但基因表達上調(diào)發(fā)生在啟動子接觸沒有變化的情況下。

有趣的是，激活標記也在下調(diào)TSSs附近獲得，而沒有抑制性組蛋白修飾的積累。然而，對差異ChIP-seq峰分布的仔細檢查顯示，激活組蛋白標記信號減少的區(qū)域更常位于下調(diào)TSSs附近，表明表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組變化之間的功能耦合。發(fā)現(xiàn)H2AK119ub信號增加的位置在上下調(diào)TSS周圍同樣存在，與最近證據(jù)一致，暗示H2AK119ub在基因抑制和激活中都有作用。一部分下調(diào)TSSs被發(fā)現(xiàn)富含Myc和YY1結(jié)合，這些是HDAC靶點的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其乙?；癄顟B(tài)可以調(diào)節(jié)其分子功能。與上調(diào)TSSs不同，下調(diào)TSSs周圍的啟動子環(huán)變得更強。還注意到在一些最強下調(diào)基因周圍形成了顯著的新生環(huán)，存在于現(xiàn)有的H3K9me3位點，僅伴有H3K9me3水平的輕度增加。這些表明抑制性染色質(zhì)接觸可能代表與基因下調(diào)相關(guān)的廣泛分子過程。

ESCs在TSA去除后恢復(fù)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)狀態(tài)

然后假設(shè)如果擾動誘導(dǎo)了細胞記憶，染色質(zhì)和基因表達變化應(yīng)該在初始因果事件之后持續(xù)存在。為此，清洗TSA處理的細胞并讓它們恢復(fù)24小時（大約兩個細胞倍增時間）。TSA去除24小時后，蛋白質(zhì)乙酰化恢復(fù)到未擾動水平，細胞世代追蹤顯示所有細胞在恢復(fù)期間都已分裂。TSA對組蛋白景觀的影響同樣容易逆轉(zhuǎn)。過量的H3K27ac、H3K4me1和染色質(zhì)可及性立即恢復(fù)，H3K27ac峰在TSSs周圍重新富集，除了H3K9ac，定量分析顯示在幾個基因組位點有輕微的持續(xù)富集。與染色質(zhì)標記的恢復(fù)一致，TSA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)幾乎完全逆轉(zhuǎn)，只有少數(shù)基因顯示殘留的失調(diào)。盡管某些基因組位點保留了略微增加的H3K27ac，但它們與保持失調(diào)的TSSs沒有強烈共定位?？傊@些數(shù)據(jù)顯示，組蛋白標記和基因表達在TSA去除后24小時通常恢復(fù)，但一小部分基因保持了對擾動的記憶。

為了排除近乎完全恢復(fù)是由于恢復(fù)時間不足的可能性，在TSA去除后48、72和96小時檢測了基因表達變化。有趣的是，差異表達基因的數(shù)量隨著恢復(fù)時間的延長而增加。相反，在更短的恢復(fù)時間（16和20小時）評估轉(zhuǎn)錄顯示，基因表達變化在24小時時最低。關(guān)鍵的是，沒有發(fā)現(xiàn)HDACs的非組蛋白靶點與持續(xù)基因表達失調(diào)之間存在任何聯(lián)系。雖然不能完全排除，但這最小化了長期轉(zhuǎn)錄后果是由于HDAC抑制的多效性效應(yīng)的可能性。

24小時恢復(fù)后，多能性網(wǎng)絡(luò)活動被有效恢復(fù)，大多數(shù)發(fā)育過程再次下調(diào)。由于mESC培養(yǎng)條件主動抑制分化，詢問有效恢復(fù)是多能細胞的一般特征，還是強加主導(dǎo)細胞狀態(tài)的生長條件的結(jié)果。因此，將mESCs培養(yǎng)成 gastruloids，在Chiron脈沖前立即用TSA處理4小時。TSA對轉(zhuǎn)錄組的影響在mESCs和 gastruloids 之間強烈相關(guān)，基因本體（GO）富集分析顯示兩種條件下類似的發(fā)育失調(diào)。清洗后（24小時內(nèi)恢復(fù)H3K27ac），讓對照和TSA處理的 gastruloids 發(fā)育3天。雖然TSA處理的 gastruloids 中神經(jīng)外胚層標記Sox2的陽性染色區(qū)域擴大，但轉(zhuǎn)錄組在很大程度上重新建立。為了增強發(fā)現(xiàn) beyond 多能細胞的相關(guān)性，測試了神經(jīng)祖細胞（NPCs）從TSA脈沖恢復(fù)的能力。這揭示，與ESCs類似，TSA去除24小時后轉(zhuǎn)錄差異很小，在48小時增加。雖然對TSA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在ESCs和NPCs中部分與類似調(diào)控通路相關(guān)，但存在細胞類型特異性差異。

總之，mESCs具有在超乙?；}沖后恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄和組蛋白修飾景觀的顯著能力。在 gastruloids 和NPCs中的發(fā)現(xiàn)支持這些觀察，即HDAC抑制對轉(zhuǎn)錄組的影響是深遠的，但從中的轉(zhuǎn)錄恢復(fù)是有效的。然而，數(shù)據(jù)也表明細胞保持了對TSA脈沖的部分記憶。

基因組結(jié)構(gòu)保留其過去構(gòu)象的部分記憶

為了進一步探索TSA脈沖是否可以被mESCs記錄，分析了恢復(fù)后的3D基因組折疊。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)構(gòu)象沒有完全恢復(fù)——順式-反式比率部分恢復(fù)，順式接觸耗竭持續(xù)存在，特別是在A區(qū)室。此外，雖然A-A相互作用在反式中有效恢復(fù)并在順式中顯示一些增加，但順式中的B-B相互作用仍然突出。同樣可以在基因水平檢測到基因組構(gòu)象的持續(xù)變化。高分辨率特征向量分解揭示了轉(zhuǎn)錄和結(jié)構(gòu)恢復(fù)變得解耦的局部實例。例如，TSA中F11、Klkb1和Cyp4v3基因座的基因表達上調(diào)將約200千堿基（kb）編碼基因組片段切換到A區(qū)室?；謴?fù)后，基因的抑制成功恢復(fù)；然而，編碼基因組片段保持A區(qū)室身份，如在TSA條件中。此外，在不完全的結(jié)構(gòu)恢復(fù)在某些基因組位點可見，其中增加的環(huán)強度在整個恢復(fù)期間保持。最后，發(fā)現(xiàn)雖然在TSA中失去強度的差異環(huán)完全恢復(fù)，但在TSA處理后變得更強的環(huán)仍然增強。

總之，基因組結(jié)構(gòu)攜帶其TSA誘導(dǎo)構(gòu)象的記憶，這在順式接觸頻率、區(qū)室相互作用和染色質(zhì)環(huán)水平上可見。

持續(xù)基因表達變化與調(diào)控性3D接觸相關(guān)

然后推理，如果持續(xù)的微小結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄變化標志著細胞記憶，那么重復(fù)暴露于TSA應(yīng)該具有更嚴重的后果。因此，使mESCs經(jīng)歷第二個TSA處理和恢復(fù)周期。雖然第二次TSA處理的效果與第一次相當，但從第二次處理恢復(fù)較不完全。數(shù)百個基因保持強烈失調(diào)，并與發(fā)育過程相關(guān)，表明重復(fù)暴露對細胞身份有更大影響。注意到這可能部分是由于第一次TSA脈沖后隨著時間延長基因表達失調(diào)增加。接下來，根據(jù)它們從任一次TSA處理恢復(fù)的能力對差異表達基因進行分層，并在雙重處理過程中繪制它們的表達。雖然大多數(shù)失調(diào)基因在其天然和異位表達狀態(tài)之間振蕩，一個基因子集顯示逐漸加重的基因表達失調(diào)，指示細胞記憶。

旨在區(qū)分恢復(fù)基因與保留其TSA誘導(dǎo)表達狀態(tài)記憶的基因的染色質(zhì)特征。首先，分析了上調(diào)TSSs周圍的組蛋白乙?；腿旧|(zhì)可及性。顯示恢復(fù)基因和未恢復(fù)基因之間沒有差異——兩組都以激活染色質(zhì)信號的增益為特征，在兩次恢復(fù)期間有效恢復(fù)。第一次恢復(fù)后保持富集的H3K9ac峰在恢復(fù)和未恢復(fù)的TSSs周圍同樣富集，表明H3K9乙?；皇怯洃浶?yīng)的原因。相反，發(fā)現(xiàn)未恢復(fù)基因處存在彌散但強大的預(yù)先存在的E-P接觸，與恢復(fù)基因相比，并且未恢復(fù)基因也表現(xiàn)出更高的形成環(huán)的傾向。接下來，在下調(diào)基因中類似的TSS分析揭示，未恢復(fù)的基因是發(fā)育抑制因子Polycomb的靶標，如啟動子周圍豐富的H3K27me3信號所示。在NPCs中也發(fā)現(xiàn)同樣的情況，表明持續(xù)的基因下調(diào)可能與多種細胞類型中的Polycomb活性相關(guān)。有趣的是，下調(diào)發(fā)生在沒有明顯H3K27me3變化的情況下。相反，發(fā)現(xiàn)Polycomb環(huán)在未恢復(fù)TSSs處獲得顯著強度，以及全基因組范圍。關(guān)鍵的是，增加的Polycomb介導(dǎo)的環(huán)在第一次恢復(fù)期后持續(xù)存在，環(huán)錨點處H3K27me3水平?jīng)]有重大變化。持續(xù)的環(huán)增強是Polycomb特有的特征，而不是一般的抑制環(huán)，因為發(fā)現(xiàn)新生的H3K9me3環(huán)有效恢復(fù)。

總之，重復(fù)的瞬時HDAC抑制觸發(fā)基因表達的細胞記憶，這與失調(diào)TSSs周圍的強大結(jié)構(gòu)特征相關(guān)——對于上調(diào)基因，突出的預(yù)形成E-P接觸；對于下調(diào)TSSs，加強的抑制性Polycomb環(huán)可能使改變的活動狀態(tài)永久化。

PRC1介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)控制持續(xù)的基因下調(diào)

由于Polycomb靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄下調(diào)發(fā)生在沒有PRC2沉積的H3K27me3標記積累的情況下，試圖了解記憶是否依賴于PRC1復(fù)合物的活性。進行了Ring1B的校準ChIP-seq分析，顯示恢復(fù)后超過8000個位點的PRC1結(jié)合增加。這些位點既沒有H3K27me3也沒有H2AK119ub顯示持續(xù)增加，與發(fā)現(xiàn)Polycomb組蛋白修飾景觀基本未改變一致。為了測試轉(zhuǎn)錄記憶是否依賴于PRC1介導(dǎo)的空間聚類，通過消耗典型PRC1的兩個亞基（PCGF2和PCGF4）破壞了Polycomb介導(dǎo)的環(huán)。雖然持續(xù)的PCGF2消耗導(dǎo)致Polycomb靶標的輕度去抑制，但對TSA-恢復(fù)雙重處理過程的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在E14、Pcgf2fl/fl-OHT和Pcgf2fl/fl+OHT細胞之間高度相似。然而，PCGF2消耗使未從TSA脈沖恢復(fù)的基因數(shù)量減少了超過兩倍，表明較弱的記憶反應(yīng)。關(guān)鍵的是，大多數(shù)在-OHT條件下顯示持續(xù)下調(diào)的基因在+OHT條件下沒有表現(xiàn)出持續(xù)下調(diào)，表明Polycomb環(huán)的破壞重寫了對TSA的記憶反應(yīng)。然而，識別了一個較小的基因子集，在+OHT細胞中顯示持續(xù)下調(diào)，這些也是Polycomb靶標。然而，雖然僅在-OHT細胞中保持下調(diào)的基因集在TSSs顯示環(huán)增加，但+OHT特有的未恢復(fù)基因沒有，并且+OHT TSS環(huán)錨點處Ring1B的增加發(fā)生在較小程度，表明它們的下調(diào)依賴于獨立于PRC1介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)的機制。

總之，Polycomb結(jié)構(gòu)域相互作用的破壞調(diào)節(jié)記憶反應(yīng)，證明PRC1介導(dǎo)的空間聚類負責TSA誘導(dǎo)的Polycomb靶基因的持續(xù)下調(diào)。

 圖2 急性HDAC抑制可引起組蛋白修飾譜與基因表達的整體性改變

討論

表觀遺傳層之間的相互作用以及它們是協(xié)同還是拮抗作用是一個活躍的研究領(lǐng)域。本研究中的發(fā)現(xiàn)描述了表觀遺傳修飾和基因組折疊之間的相互作用，它們共同調(diào)節(jié)mESC轉(zhuǎn)錄程序。即，組蛋白乙?；募毙詳_動迅速轉(zhuǎn)化為組蛋白甲基化和3D染色質(zhì)組織的變化。雖然大多數(shù)表觀基因組變化是可逆的，但發(fā)現(xiàn)3D基因組折疊的某些改變持續(xù)存在，并與一部分基因組位點的轉(zhuǎn)錄記憶效應(yīng)相關(guān)。

除了啟動子處染色質(zhì)的一般開放和激活外，在TSA處理上觀察到廣泛的H3K4me1沉積，暗示新增強子的部署。這些可能是基因上調(diào)的主要驅(qū)動因素，因為先前研究表明增強子景觀——而不是啟動子活性——對譜系決定更為重要。因此，增強子是基因組中最表觀遺傳動態(tài)的區(qū)域，解釋了它們對染色質(zhì)狀態(tài)平衡破壞的敏感性。有趣的是，發(fā)現(xiàn)H3K27乙酰化似乎先于H3K4me1沉積，這對增強子激活中普遍接受的事件序列提出了疑問，其中H3K4me1應(yīng)該先于H3K27ac。一旦觸發(fā)，增強子活性的維持是一個主動過程，解釋了一旦乙?；癄顟B(tài)恢復(fù)，增強子景觀和轉(zhuǎn)錄程序的有效恢復(fù)。發(fā)現(xiàn)基因上調(diào)發(fā)生在E-P接觸沒有變化的情況下，這與最近將基因激活與增加物理接觸頻率的需求解耦的研究一致。相反，發(fā)現(xiàn)預(yù)先存在的E-P接觸與記憶效應(yīng)相關(guān)。實際上，認為預(yù)形成的E-P接觸可能使一些基因預(yù)備激活，但需要額外的觸發(fā)器才能發(fā)生轉(zhuǎn)錄。推測過量的組蛋白乙?；せ钤鰪娮?，那些在結(jié)構(gòu)上與其啟動子靶標具有高接觸概率的增強子可以在異位乙?；コ缶S持主動轉(zhuǎn)錄。

雖然染色質(zhì)環(huán)通常在與E-P接觸的背景下討論，但本研究強調(diào)了抑制性染色質(zhì)環(huán)的重要性和效力。反直覺地，發(fā)現(xiàn)異位染色質(zhì)激活增強了以抑制性染色質(zhì)特征標記的位點之間的環(huán)。一類這樣的環(huán)對應(yīng)于Polycomb接觸，這些接觸是TSA誘導(dǎo)的基因表達持續(xù)下調(diào)的核心。在神經(jīng)祖細胞中，已知Polycomb位點在順式中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄記憶，并且這種記憶與PRC2和激活信號之間的拮抗作用相關(guān)。因此，一種可能的解釋是，異位全基因組染色質(zhì)激活將激活復(fù)合物從Polycomb靶標吸引走，將平衡轉(zhuǎn)向基因下調(diào)。關(guān)鍵的是，由于持續(xù)的基因下調(diào)涉及啟動子處H3K27me3-H3K27ac平衡的最小變化（如果有），Polycomb位點的增強空間隔離似乎是抑制機制的核心，構(gòu)成基于結(jié)構(gòu)的記憶。實際上，Polycomb介導(dǎo)的空間聚類的破壞調(diào)節(jié)了由TSA觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄記憶反應(yīng)。這與先前的發(fā)現(xiàn)一致，表明除了局部染色質(zhì)壓縮外，長程接觸是Polycomb復(fù)合物賦予沉默的一種機制。還檢測到H3K9me3標記位點之間的顯著環(huán)作為基因下調(diào)的潛在機制。研究H3K9me3接觸是否由染色質(zhì)結(jié)合蛋白如HP1及其相關(guān)伙伴介導(dǎo)可能是有趣的。

急性破壞乙?；坝^也導(dǎo)致全局基因組折疊的重要變化。反式接觸的增加指出組蛋白乙?；赡苁侨旧w內(nèi)相互作用和染色體領(lǐng)土的重要決定因素。實際上，已經(jīng)表明長的、高度轉(zhuǎn)錄的基因或基因密集區(qū)域從染色體領(lǐng)土延伸，盡管這歸因于核糖核蛋白與新生轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合，而不是乙酰化狀態(tài)本身。使用生物物理建模，發(fā)現(xiàn)通過增加染色質(zhì)纖維的剛度，可以概括在TSA中觀察到的反式接觸比率。廣泛接受的是，相同表觀遺傳狀態(tài)結(jié)構(gòu)域之間的同型相互作用是染色體區(qū)室化的主要驅(qū)動力。有趣的是，全局染色質(zhì)激活削弱而不是加強了A-A區(qū)室相互作用，其程度與ESC分化過程中發(fā)生的相當。進行的模擬以了解增加的染色質(zhì)剛度是否會導(dǎo)致過量的反式接觸，有效地預(yù)測了在Micro-C數(shù)據(jù)中觀察到的區(qū)室相互作用的變化。這表明染色質(zhì)剛度不僅是染色體間接觸的重要生物物理決定因素，也是A/B區(qū)室化的重要決定因素。

值得注意的是，發(fā)現(xiàn)擾動的區(qū)室相互作用可以在恢復(fù)期后部分持續(xù)，表明3D結(jié)構(gòu)攜帶其過去狀態(tài)的記憶。這可以通過滯后現(xiàn)象（系統(tǒng)行為對其歷史的依賴性）來解釋。滯后是3D基因組組織中的一個新興原則，發(fā)現(xiàn)對模擬基因組折疊的某些特征至關(guān)重要，并已通過實驗證明。此外，生物物理建模表明3D基因組折疊可能是穩(wěn)定表觀遺傳記憶的關(guān)鍵元素。本研究進一步支持這些觀察，并在全局尺度和基因水平提供了結(jié)構(gòu)記憶的經(jīng)驗證據(jù)。

最后，細胞記錄先前刺激并觸發(fā)對后續(xù)刺激的增強反應(yīng)的能力對人類健康具有潛在影響，因為常用的表觀藥物在治療期間反復(fù)施用。因此，暴露的細胞可能經(jīng)歷多個急性反應(yīng)隨后恢復(fù)的循環(huán)，潛在地誘導(dǎo)值得進一步研究的長期效應(yīng)。

[1] Transient histone deacetylase inhibition induces cellular memory of gene expression and 3D genome folding